广泛代谢组实验样本前处理标准操作流程

 

　　样本准备是前处理的前提，核心在于避免污染与代谢物降解。采集样本时需遵循快速、低温原则，所有操作尽量在冰上进行，避免样本长时间暴露于室温。不同类型样本需针对性处理：细胞样本需用预冷PBS清洗2-3次去除培养基残留，离心收集后液氮速冻；组织样本需快速去除血液、杂质，按250mg/管分装后液氮冷冻；体液样本中，血清需室温静置凝固后离心，尿液需离心去除沉淀，唾液需禁食1小时后采集并过滤除菌。所有样本需做好清晰标记，分装后置于-80℃保存，严禁反复冻融。

 

　　样本破碎与匀浆旨在打破生物壁垒，释放胞内代谢物。冷冻样本需在低温环境下解冻，避免代谢物变性。组织样本采用液氮研磨或组织匀浆法，加入预冷提取溶剂后充分研磨至匀浆状态；细胞样本可直接加入提取溶剂，涡旋震荡使细胞裂解。破碎过程中需全程低温，所用器械需经灭菌处理，避免交叉污染，同时避免使用含染料的耗材及保鲜膜，防止PEG等杂质干扰检测。

 

　　代谢物提取是核心步骤，需根据代谢物极性选择合适溶剂体系。常用提取溶剂包括甲醇、乙腈等，极性代谢物可选用甲醇-水混合体系，脂类代谢物可选用氯仿-甲醇体系，溶剂与样本体积比控制在3:1至10:1之间。提取时加入内标物以校正提取效率，涡旋震荡1-10分钟后，4℃下12000-15000g离心10-20分钟，收集上清液，沉淀可重复提取一次以提高回收率，合并两次上清液备用。

 

　　净化与浓缩用于去除杂质，提高检测灵敏度。上清液可通过0.22μm滤膜过滤，去除蛋白质、细胞碎片等大分子杂质；若样本杂质较多，可采用固相萃取法进一步净化。净化后的样本采用氮吹或真空浓缩法浓缩，避免高温导致代谢物降解，浓缩至合适体积后，用提取溶剂定容，涡旋混匀后再次离心，确保样本澄清。

 

　　样本保存与质控是实验可靠性的保障。处理后的样本需分装至无菌离心管，做好标记后置于-80℃保存，待检测时快速解冻并立即上机。同时，需制备质控样本，混合所有样本等量上清液，按相同流程处理，用于监控前处理及检测全过程的稳定性。整个操作过程需严格遵循无菌原则，所用试剂均为色谱级，溶液现配现用，确保实验重复性与结果准确性。